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夏俊珂，代鹏，王晓锋，等.基于游离DNA单分子标签检测技术的苯丙酮尿症无创产前检测：4例分析[J].中华围产医学杂志,,24(2):-.DOI：10./cma.j.cn--

夏俊珂1　代鹏1　王晓锋2　赵干业1　刘宁1　孔祥东11医院妇产科遗传与产前诊断中心　；2人和未来生物科技（长沙）有限公司　通信作者：孔祥东，Email：kongxd

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苯丙酮尿症（phenylketonuria,PKU）主要是由编码苯丙氨酸羟化酶的基因（PAH）突变，引起血苯丙氨酸（phenylalanine,Phe）浓度增高，并引起一系列临床症状的常染色体隐性遗传病。中国人群PKU的总体发生率为1/（~）。PKU的主要临床表现包括智能低下、癫痫发作、孤独症等。目前PKU的主要治疗方法是低苯丙氨酸饮食控制疗法，但治疗费用高，疗效不稳定，且依从性差，一些患儿仍受到疾病影响。产前诊断是预防PKU患儿出生的有效方法。传统的介入性产前诊断胎儿取材为有创操作，存在胎儿感染和流产等风险，给孕妇及家庭造成了较大的心理负担。

自年发现孕妇外周血中存在胎儿游离DNA（cell-freefetalDNA,cffDNA）以来，无创产前检测（non-invasiveprenataltesting,NIPT）已经广泛用于胎儿常见染色体非整倍体的筛查及染色体结构异常的检测。NIPT检测单基因遗传病的关键在于寻找与母体不同的胎儿特异性遗传分子片段，但cffDNA中母体基因所占比例较高，对胎儿致病基因检测存在较大干扰，使得NIPT最初局限于鉴定有无新发突变或父源性遗传物质。微滴式数字聚合酶链反应（dropletdigitalpolymerasechainreaction,ddPCR）以及基于大规模平行测序技术构建的单倍体相对剂量模型，使检测母源性常染色体隐性遗传病成为可能，并已经应用于地中海贫血、先天性肾上腺皮质增生症、进行性肌营养不良等的无创产前基因检测。但由于ddPCR需要针对不同家系的突变设计相应探针，而且cffDNA片段较短，在探针和引物设计方面难度较大，因此短期内难以普及。年Lv等利用环化单分子扩增和重测序技术（circulatingsingle-moleculeamplificationandresequencingtechnology,cSMART），成功对肝豆状核变性进行了无创产前基因检测。随后cSMART技术也成功应用于耳聋和苯丙酮尿症的无创产前基因检测。但是由于cffDNA片段短、含量低，cSMART技术应用于单基因病的无创产前诊断还面临着技术挑战。

基于二代测序（nextgenerationsequencing,NGS）的血浆游离DNA等位基因分子计数系统，即游离DNA单分子标签检测技术（cell-freeDNAbarcode-enabledsingle-moleculetest,cfBEST），可利用多重半锚定巢式PCR原理，经过2次PCR测序文库，实现对DNA片段的基因突变检测，评估胎儿的基因型。Yang等利用该技术成功应用于?-地中海贫血的无创产前诊断。本单位将该技术用于4例PKUPAH基因的无创产前检测，现将结果报告如下。一、资料与方法

1.研究对象：研究对象为年7月至9月在医院要求进行产前诊断，且曾生育PKU患儿的孕妇，共4例。纳入标准为：（1）先证者临床诊断为PAH基因（参考转录本：NM_.3）复合杂合点突变导致的苯丙酮尿症。（2）先证者父母均为杂合突变携带者。（3）先证者的基因突变类型均为已知致病性点突变。本研究经医院伦理委员会批准（-KY-），所有研究对象均签署知情同意书。

2.DNA提取：（1）孕妇血浆DNA提取：孕11~20周，取5~10ml孕妇外周血，乙二胺四乙酸抗凝，×g，4℃离心10min，4h内完成上层血浆分离。使用血浆游离DNA提取试剂盒（德国QIAGEN公司），按照标准操作方法提取血浆DNA，并溶解于45μl洗脱液中，用于计算cffDNA。（2）孕妇白细胞DNA提取：按照QIAampDNABloodMini试剂盒（德国QIAGEN公司）说明书操作步骤，提取白细胞DNA，最后将DNA溶解于50μl洗脱液，用于引物性能测试。（3）采集先证者（或先证者父亲）静脉血2~3ml，按前述提取孕妇白细胞DNA的方法提取DNA，用于引物性能测试。

3.cfBEST检测引物设计：根据先证者和孕妇本人的基因检测结果，在突变点上下游各60bp范围内，分别设计朝向突变点延伸的2轮巢式聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）扩增引物。从dbSNP数据库（