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日前，青欧生命科学高等研究院医院、丹麦奥胡斯大学生物医药系开发了新型可治疗杜氏肌营养不良（DMD）的基因编辑治疗方法。该方法利用CRISPR介导非同源平末端连接的方式（简称为NHBEJ），实现有效、精确修复抗萎缩蛋白基因突变。结合成纤维细胞至肌管细胞重编程技术，该研究证明NHBEJ技术能够有效恢复细胞中正常抗肌萎缩蛋白的表达，为DMD患者治疗带来希望。该研究成果于今年3月13日以“EfficientCorrectionofDuchenneMuscularDystrophyMutationsbySpCas9andDualgRNAs”为题，发表在国际著名学术刊物《细胞》（Cell）出版社旗下的MolecularTherapyNucleicAcids期刊，下面让我们详细了解一下这项研究内容。杜氏肌营养不良简介杜氏肌营养不良症（DMD）是一种X染色体隐性遗传的单基因罕见遗传疾病，会引发致命的神经肌肉病变，全球平均每个新生男婴中就有一人罹患此病。DMD是由于编码抗肌萎缩蛋白的基因DMD发生突变引起的。患者一般在3-5岁开始发病，最早表现出进行性腿部肌无力(爬楼梯困难)，导致不便行走。12岁时失去行走能力，常年与轮椅为伴，然后逐渐丧失独立完成日常生活活动的能力，如使用厕所、洗澡和进食。最终，由于呼吸肌功能障碍导致呼吸困难加重需要通气支持，心功能障碍可导致心力衰竭，在缺乏优秀辅助呼吸技术的情况下患者通常在20多岁时去世。已有的DMD基因治疗方法DMD基因共有79个外显子，其中外显子3-9和45-55为突变的热点位置，分别占7％和47％。在导致DMD的突变类型中，70％为移码突变，30％为点突变。目前比较热门的治疗DMD的方法为外显子跳跃法。以53号外显子突变为例，可以使用反义寡核苷酸（AON）在mRNA前剪接过程中靶向特定外显子，使53号外显子沉默，从而表达出部分功能正常的抗肌萎缩蛋白。或利用基因编辑的方法，删除外显子或废除剪接位点，使突变外显子不包含在mRNA中。但这些方法有一定局限性，对于非3整数倍编码氨基酸的外显子使用外显子跳跃治疗，一样会导致后续转录出的氨基酸序列错乱，无法产生正常功能的抗肌萎缩蛋白。图一、DMD基因治疗策略（Duan,D.,Goemans,N.,Takeda,S.etal.Duchennemusculardystrophy.NatRevDisPrimers7,13().）本研究开发的DMD基因治疗新方法在本文研究中，我们通过在人细胞系中共转染32对gRNA验证了SpCas9和双gRNA引入的DNA双链断裂主要通过非同源平末端连接（NHBEJ）的方式修复，在所有修复类型中NHBEJ占比高达80%。这种可预测的DNA双链断裂修复方式，为基因治疗提供了一种精确且更具预测性的方法。图二、双gRNA介导的NHBEJ修复示意图我们使用NHBEJ策略可以在移码突变位点附近，进行精准有效的移码修复，这为DMD患者提供了新的治疗方法。以45号外显子缺失为例：外显子45缺失导致46号外显子产生+1bp的移码，在转录过程中会提前引入终止密码子，导致截断的突变转录本被降解，而无法正常翻译dystrophin蛋白。然而用双gRNA对EX44进行编辑，删掉3N+1bp个碱基，则刚好与EX46形成移码修复。但需要考虑的是删掉3N+1bp后不能给EX44引入终止密码子。根据这一原则我们设计了两对gRNA，对DMDEX45缺失的成纤维细胞进行修复，并用hMyoD（肌分化因子，一种生肌调节因子）将编辑后的成纤维细胞诱导为肌管细胞，在转录组和蛋白水平上，均检测到了DMD表达的恢复。图三、利用NHBEJ策略对DMDEX45del模型基因治疗原理图图四、利用NHBEJ策略成功恢复转分化DMDEX45del肌管中dystrophin的表达应用展望目前FDA已经批准外显子跳跃原理治疗肌营养不良的药物，由于其原理是部分恢复抗肌萎缩蛋白的功能，仍存在很多的提升空间。CRISPR基因编辑技术在基因治疗上的应用已经得到广泛的