疾病简介
杜氏进行性肌营养不良（Duchennemusculardystrophy,DMD）为X-连锁的隐性遗传病，由抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因（亦称DMD基因）的突变所致的肌源性损伤。DMD基因的突变还可引起临床上症状较轻的一种亚型——贝氏进行性肌营养不良(Beckermusculardystrophy,BMD)，一般以12岁能否还能行走来区分。国外报道，DMD发病率约为1/活产男婴；大约2.5%女性携带者因不幸的莱昂化而得病，但症状要比男性轻。目前对DMD/BMD和SMA尚无有效的治疗方法，因此应用简便、准确的方法检测致病基因携带者及提供产前基因诊断就成为预防与减少发病的唯一有效的途径。
DMD基因位于Xp21，基因组DNA片段长约2.3Mb，由79个外显子组成，cDNA长度约14kb。在DMD基因内存在许多重复序列，形成许多断裂和交换热点，导致基因缺失/重复，并容易发生新生突变。
DMD基因突变的主要类型是基因片段缺失，在基因的5’端和3’端分别存在一个缺失高发区，尤其是后者，在外显子51区域成为高峰，近80%的缺失突变发生在这个区域。大范围（一个或数个外显子，甚至整个基因）的缺失型病例占60%，重复型突变占6%，还见到缺失区域不连续或者同一患者既有缺失又有重复的突变。通过序列分析显示，微小缺失占3%、单核苷酸改变占29%。通过基因分析，98%的DMD患者可以明确其基因突变细节。
临床诊断
杜氏进行性肌营养不良主要依据临床表现、发病年龄、受累的肌肉群以及肌电图血清酶检查，必要是做肌肉活检和病理检查。DMD患者多在4岁以前发病，肌肉无力从四肢近端和躯干开始，下肢重于上肢。首发症状是骨盆带肌肉无力，表现为鸭步、易跌倒，登台阶和由蹲位站起时困难、由卧位起身时表现为Gowers征（先转成俯卧位，然后双手支撑双脚、膝盖等处，才能缓慢站起），有腰椎前凸，四肢近端肌肉逐步萎缩，进行性加重，腓肠肌假性肥大，触之坚硬。肌电图表现为肌源性损害，肌肉收缩时动作电位波幅降低、间隙缩短，单个运动单位的范围和纤维密度减少，多项电位中度增加。血清学指标磷酸肌酸激酶（CPK）高度升高（后期升高不明显），并伴有肌红蛋白（Mb）、丙酮酸激酶（PK）活性升高，醛缩酶和谷草转氨酶也可增高，尿中肌酸增加，肌酐减少。肌肉活检可见肌纤维横切面变圆、直径大小不一，肌纤维萎缩变性，脂肪及结缔组织增生。
这些症状和体征及化验结果都不单独具有特异性，必须综合起来考虑。主要有男孩患病、起病早、鸭步、腓肠肌肥大、上台阶困难、Fowers征阳性、CPK高度升高和肌电图肌源性损害等8项。
患者一般在20岁左右因并发症而死亡，近来因为家庭护理改善，有些病人会回到近30岁。BMD较DMD轻，发病也晚些，少数患者可以结婚生子，极少数寿命可达60多岁。
产前基因诊断的策略
产前诊断是在妊娠的早期，通过胎儿材料的DNA分析，针对性地检测胎儿是否存在与先证者相同的基因缺陷。因此产前诊断的前提是要事先进行先证者的分析，确定其基因突变的细节及在该家系中实行产前诊断的途径和策略。
一、产前诊断的时间
产前诊断有两个时间窗口：首选是10-12孕周，采集绒毛；次选是15-18孕周，采集羊水。选择绒毛的理由有三条：一是防止母源污染，由于DMD主要以缺失型突变为主，母源污染将导致诊断错误，血性羊水若不经过培养，则成隐患，而绒毛可以通过的形态检查，准确挑选；二是早期诊断，如果胎儿受累，处理起来比较方便；万一取材失败或分析中出现问题，可以在稍后时间取羊水；而采集羊水在孕中期，万一发生血性污染需要进行羊水培养时，回旋的余地太小，更不用说重新取样了。三是绒毛提取的DNA质好量多，成功率高。
二、产前诊断的步骤
21三体检测。产前诊断的第一步是进行21三体的检测，通过该项检测，可以达到“一石三鸟”的效果，避免差错。首先是检测21三体，因为在二次生育时孕妇的年龄普遍偏大，生育21三体的风险大大提高；二是判断是否有母源污染及污染的程度，有时会出现采集到材料完全是母源的情况；三是核对分析的DNA材料是否有混乱，后两点是导致差错的主要原因。
胎儿性别检测。如果胎儿为男性，则继续对胎儿进行DNA分析，确定胎儿是否获得突变等位基因。如果是女性胎儿，可以停止基因诊断。
基因分析。为了保证产前诊断的准确性，应该采用两种不同的诊断途径独立进行分析。
如果家系进行了预先分析，则针对性选择检测位点：
缺失型突变：连锁分析+缺失外显子PCR
重复型突变：连锁分析+重复区域MLPA
点突变：连锁分析+突变点检测（AS-PCR或测序）
没有进行过预先分析的家系，可以应用“一步到位法”诊断程序：
缺失型突变：用相应外显子PCR验证
“甄别程序”：“非缺失型”突变，获得致病基因标记或发生染色体互换时，对先证者作MLPA分析，先证者存在缺失/重复，而胎儿不存在突变，则可排除胎儿受累。没有外显子缺失/重复时，在时间充裕，应进行DNA测序。若时间紧迫，可选择检测羊水CK检测或胎儿肌肉活检，确定胎儿是否受累。在检测缺失时，要设置内对照，确认目标基因片段没有扩增不是由于PCR反应的失败（内对照扩增阳性），保证分析的真实性。
产前诊断的技术方法
联合应用各种基因突变检测技术，可以对绝大部分DMD的致病突变进行鉴定，对于不能鉴定出突变的个体，应该考虑诊断是否准确。
一、基因缺失的检测
Southern印迹法是检测基因缺失的经典方法，PCR技术的应用使得缺失突变的检测变得更简便、直观。常用多重外显子PCR扩增，目前有各种定量检测基因片段缺失的方法可供选择，例如定量-PCR(quantitative-PCR,Q-PCR)、多重可扩增探针杂交（multiplexamplifiableprobehybridization，MAPH）、多重连接依赖式探针扩增(Multiplexligation-dependentprobesassay,2MLPA)技术，可以对基因的79个外显子进行缺失/重复分析。联合应用各种DNA分析手段，对于DMD的致病突变综合检测能力达到98%，只有个别病例突变细节不明，因此基因诊断可以直接确诊DMD患者，避免采用损伤性的肌肉活检病理学诊断；而BMD病例的检测能力只有60%，需要做进一步的工作。用芯片杂交技术替代电泳，分析MLPA的检测结果，可以克服电泳分析受片段长度的限制，提高了单次检测的效率。
二、点突变的检测
对于非缺失型DMD突变，应用DHPLC或高分辨溶解缺陷分析（highresolutionmeltingcurveassay,HRM），可以筛查出突变所在的扩增片段，然后通过PCR产物直接测序，确定突变细节。但DNA分析手段不能检测到深埋在基因内含子中或基因调控序列中的致病突变。用外周血提取mRNA，经逆转录成cDNA，再分段进行PCR、电泳、测序，可以大大减少工作量。如果出现扩增片段的数目和长度的改变，就可以直接判断基因的缺失/重复突变；对于涉及单个外显子的缺失或长度改变，应该进行DNA水平的验证，确定是真实的单个外显子缺失/重复还是由于点突变导致了剪接异常，最后通过测序确定突变细节；对于没有发生改变的其他患者，再逐个对RT-PCR片段进行突变筛查和测序。
遗传咨询
一、受累胎儿的处理，由父母知情选择。
二、新生突变与生殖腺嵌合
DMD病例中，新生突变多见，这是DMD的另外一个特点，表现为没有家族史、散发性。严格的新生突变是指发生在减数分裂过程中的差错，再次发生的可能性不高。但DMD基因中存在高度重复的结构，决定了该基因不仅在减数分裂过程中易发生差错，而且在有丝分裂的过程中也发生差错，不仅在女性的两条X染色体之间发生，在男性的一条X染色体内也可以发生。
在临床分析中，即使母亲外周血分析结果显示为多态性杂合的情况，也难以判断一个散发病例是严格意义上的新生突变还是生殖腺嵌合或体细胞嵌合。当母亲为生殖腺嵌合时，再次生育的风险取决于突变卵母细胞所占的比例，虽然可以排除患儿的姨是携带者的可能，但患者的姐妹是否携带者可能排除，需要同时分析患者、患者父母及姐妹的DNA方能确定，判断的依据如同家族性病例。由于这种不确定性，在临床实践中对于散发病例的再次妊娠都应该提供产前诊断。
在散发病例中，有些突变可能来自外祖父，也可能来自更上一辈的女性祖先。以前我们注意到上辈女性来源的突变，而忽视了父源突变。在遗传咨询时要注意，应该分析患者突变基因的亲源，如果为外祖父来源的突变，则姨的携带者身份不能轻易排除。
三、女性携带者患病风险
在X连锁的隐性遗传病中，女性携带者一般不患病，但由于女性的X染色体存在莱昂化现象，有少数携带者会因不幸的莱昂化而得病。
所谓“莱昂化”是指X染色体的灭活现象，人类女性的两条X染色体中有一条X染色体在胚胎早期发生随机失活，即有些细胞是父源的X染色体失活，有些则是母源的X染色体失活，因此女性体内有两种细胞群。女性杂合子的正常基因所在的X染色体发生莱昂化，细胞功能异常，在肌肉组织中如果不幸的莱昂化细胞占优势，个体就会患病。但由于杂合子女性个体的组织中还有一些细胞是正常的（缺陷基因所在的X染色体失活），因而相对于男性患者来说，症状要轻。
在产前诊断中，对女性胎儿不要进行深入分析，尤其是在散发病例时，不要轻易将携带者的帽子戴到她们的头上。即使是携带者，也要遵循知情同意的原则，留待这些女孩成年之后再进行分析。也许到她们生育的时候，对DMD会有了有效的治疗手段了。
四、染色体互换
由于DMD基因庞大，基因内重组率高达13％以上。在对非缺失型病例进行产前诊断或进行家族性病例携带者检测时，要注意检测重组事件。应在基因两端各选取一个多态性位点，与基因内至少一点多态性位点进行三点联合分析。一旦检测到染色体互换，对于胎儿基因型的推断就要考虑其可靠性。可以进一步分析外祖父的血样，确定致病基因来源的同时，确定孕妇的两个基因的单体型，从而判断染色体互换是发生在先证者，还是发生在胎儿。一般是发生了互换的基因携带变异的可能性最大。最稳妥的策略是鉴定先证者的突变细节，然后对胎儿进行甄别。
质量控制
对于缺失型病例，母源污染将是一个严重的威胁，是导致诊断错误的重要根源。在实施产前诊断时，最好采用胎儿绒毛组织，经过精心挑选，去除可能的母源物质。如果使用羊水细胞，当有血性污染，要进行细胞培养。采用的途径应该直接检测基因突变（缺失检测）与多态性连锁分析同时并举，当多态性标记出现额外等位基因时（母源的），提示母源污染的可能。在产前诊断程序中，常规使用21号染色体上的STR标记检测，既可以排除胎儿21三体的可能，又可以帮助确认是否存在母源污染。应用基因拷贝数定量分析，可以确定缺失型突变的家系胎儿出现微弱的阳性信号是否为污染所致。因为轻微的母源污染虽然导致了胎儿出现阳性扩增，但其信号应该较弱，剂量将不会达到1。当然，肉眼可见的血性污染，则不能这样处理，而是要进行羊水培养，去除母血污染。
参考文献
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