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核型分析和分子细胞遗传学技术一般适用于染色体病，而诊断单基因病（孟德尔遗传病）、多基因病、线粒体基因病和体细胞遗传病的最直接方法是基因诊断。

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染色体核型分析

在生物细胞有丝分裂中期，松散的染色质丝螺旋化形成可辨认的染色体，目前G显带技术最为常用。

图为G带核型照片，图示为：46，XY（正常男性）

辨别各对染色体时的常用形态指标是：测量染色体的长度、确定着丝点的位置、副缢痕及随体的有无。染色体的长度较不固定，受遗传、环境因素的影响较大，但一般认为在一个细胞内的各条染色体的伸长和缩短是同比的。因此，目前一般用相对长度来表示每条染色体的长度。

常见的常染色体病有：21-三体综合征，其次为18-三体综合征、13-三体综合征、5p综合征等；

常见的性染色体病有：性腺发育不全症和先天性睾丸发育不全症。

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分子细胞遗传学分析技术

传统显带技术能够准确诊断染色体数目异常，但对低于5MB的染色体结构畸变就无能为力了。

利用DNA探针检测染色体的分子细胞遗传学技术能很好提高染色体病检测分辨率和准确性。

1、荧光原位杂交（FISH）

利用某条染色体或区带的特异DNA探针，连接有荧光染料，利用DNA碱基互补配对原则与染色体杂交，在荧光显微镜下观察即可检测染色体。

图示为FISH模式图与显微镜下照片

2、微阵列芯片杂交技术

传统的核型分析和FISH操作繁琐、分辨率低，不能覆盖全基因组。

基于DNA芯片的比较基因组杂交技术（aCGH）和单核苷酸微阵列（SNParray）的出现解决了上述难题。

这两种技术的原理是将待测DNA与正常对照DNA分别用红色和绿色荧光染料标记并混合，然后与全基因组DNA芯片或SNP芯片进行杂交。杂交后的芯片经激光扫描计算机分析检测缺失或重复。

芯片杂交检测原理

常见的微结构遗传染色体病有：22q11.2微缺失综合征，1p36微缺失综合征，Prader-Willi综合征，猫叫综合征，Angelman综合征，Williams综合征等。

染色体微缺失重复检测方法

针对临床诊断明确的，可仅采用FISH检测，在目的区域选取相应探针，或采用定量PCR对目标区域进行定量检测。

对于临床诊断不明确的疑似病例，目前首选微阵列技术，即芯片技术，由于其能一次性对所有染色体的拷贝数进行检测，既达到诊断目的，又可完成鉴别诊断。

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基因突变检测技术

基因突变的检测技术多种多样，不同的病选择相适合的检测技术。下面着重讲下目前比较常见的三种检测技术。

DNA突变检测技术一览

1、DNA直接测序（Sanger测序）

一代测序，经典的DNA测序技术，也称Sanger测序法，是基因诊断测序的“金标准”。主要针对长度~bp（一个bp为一个碱基）的DNA片段。

一代测序原理示意图及最终结果图

在4个DNA合成反应体系（含dNTP）中分别加入一定比例带有标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应。

一代测序仪主流厂家目前只有一家，ABI公司（被LIFE收购，LIFE被THERMO收购）。

2、多重连接依赖式探针扩增（MLPA）

MLPA技术是一种高通量、针对待测DNA靶序列进行定性和半定量分析的方法。MLPA所需样本量小，可用于检测外显子或正个基因的缺失、重复。MLPA技术融合了DNA探针杂交和PCR技术的特点，但MLPA不能反映平衡易位和倒位现象。

常见的应用MLPA技术检测的遗传病有：杜氏肌营养不良（DMD），脊髓性肌肉萎缩症（SMA），苯丙酮尿症（PKU），先天性肾上腺皮质增生等。

3、二代测序（NGS）

NextGenerationSequencing，是相对于一代测序的新一代测序，又称高通量测序。

（1）目前市场占有率最高的是illumina测序平台

Illumina原理：

桥式PCR+4色荧光可逆终止+激光扫描成像

主要步骤：

①DNA文库制备——超声打断加接头

②Flowcell——吸附流动DNA片段

③桥式PCR扩增与变性——放大信号

④测序——测序碱基转化为光学信号

优劣势：Illumina的这种测序技术每次只添加一个dNTP的特点能够很好的地解决同聚物长度的准确测量问题，它的主要测序错误来源是碱基的替换。而读长短（bp-bp）也让其应用有所局限。

（2）LIFE公司的IonTorrent测序平台

IonTorrent原理

油包水PCR+4种dNTP车轮大战+微电极PH检测

主要步骤：

①DNA文库制备——喷雾打断加接头

②乳液PCR——注水入油独立PCR

③微电极pH检测——磁珠入池记录pH

优劣势：IonTorrent不需要昂贵的物理成像设备，成本相对较低体积较小，同时操作更为简单，整个上机测序可在2-3.5小时内完成（文库构建时间除外）。其劣势在于芯片的通量比不上illumina，非常适合小基因组和外显子验证的测序。

目前三代测序技术正在如火如荼的发展中，包括：

瀚海基因GenoCare（Helicos公司的继任者）；

PacificBiosciences公司PacBioSequel和PacBioRSⅡ两款测序仪；

OxfordNanopore公司纳米孔测序技术等。

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