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今日，小知为大家推荐一篇（新鲜出炉，先睹为快）即将于今年6月3日发表于CellStemCell（IF23.）脊柱肌骨方向的文章，题为microRNA靶向限制骨骼肌间充质基质细胞的成脂转化。

该文章发现了miR--Runx1轴调节FAP的成脂分化，miR-与Runx1转录本结合影响Runx1的翻译，抑制FAP的成脂分化。这表明该途径可能为将来的治疗性干预提供一种手段，限制骨骼肌中的脂肪浸润。

背景

Duchenne型肌营养不良症是最常见的伴x隐性遗传性肌病，由Duchenne()首先描述，发病率约为1/活男婴，无地理或种族间明显差异。患儿呈明确家族性。患儿均为男性，多在3-5岁发病；起病隐袭，大部分患儿坐、立时间正常，50%病儿开始行走较正常儿童晚(15个月后)，开始症状多为行走慢，不能正常跑步，容易跌倒；骨盆带肌肉无力，肌张力降低，双腓肠肌假性肥大，一般至9-12岁患儿不能行走，要坐轮椅。骨骼肌对于力量生成，运动，体温调节和代谢稳态是必不可少的。该结构由平行的肌纤维以及相关的肌肉干细胞（MSCs）和间质细胞组成。然而，当这种结构在肌肉营养不良或正常衰老过程中被脂肪和纤维化组织浸润时，这种结构就会变得混乱。脂肪和纤维浸润来源的主要细胞类型是间充质基质细胞群，被称为纤维生成原祖细胞（FAP）。FAP具有分化多能性，具有成纤维，成脂，成软骨和成骨的潜力。在健康的肌肉中，FAP对于维持体内骨骼肌的动态平衡至关重要。肌肉损伤后，FAP也已被证明对于免疫细胞募集和MSC分化以保证骨骼肌再生至关重要。但是，FAP在受损或退化环境中的失控会转化为有害的脂肪细胞生成。防止FAP向脂肪细胞转化对于防止衰老或退行性疾病发生中维持骨骼肌功能具有重大意义。然而，对调控其变化的分子机制知之甚少。因此，本期分享的文章专注于确定FAPs成脂分化的分子机制。

实验结果

1、将新分离的FAP诱导向脂肪分化并鉴定调控细胞命运相关的miRNA

FAPs是肌内脂肪浸润的来源。为了研究FAP介导的脂肪形成的分子机制，通过FACS纯化FAP，并在体外诱导成脂分化（图1A和1B）。诱导后6天，有86％的细胞变为Perilipin阳性的脂肪细胞（图1B）。同时，在成脂诱导分化后24小时（为了确定基因调控作用）进行miRNA转录组测序（图1C），发现40个miRNA的差异表达（图1D），包括miR-，miR-被认为仅在肌肉组织的成肌细胞中起作用的miRNA，但最近的其他研究中发现在其他细胞类型中也可以被检测到。之前研究表明，miR-在成肌前体细胞中增加，靶向Pax3，Pax7，MMD和Cx43的转录本，抑制其表达，从而促进成肌分化。在FAP中，miR-的表达增加，在成脂分化诱导后显着下降（图1E）。FAP成脂后miR-表达下降表明miR-可能在FAP转分化为脂肪细胞中起作用（图1D和1E）。为了验证这一点，使用miR-抑制剂和模拟物来观察miR-对于FAP成脂分化的影响，抑制miR-促进成脂分化（图1F）。增加miR-的表达抑制了成脂分化（图1F）。数据表明，miR-可以调节FAP的成脂分化。

Figure1

2、miR-的缺失会导致miR-KO小鼠肌肉损伤后的脂肪浸润增加

构建miR-KO小鼠且miR-敲除并不会影响肌肉正常发育，将miR-KO小鼠进行肌肉损伤造模，发现分别造模7天和14天后，miR-KO小鼠肌肉组织中脂肪浸润明显增加。通过向miR-KO的FAP细胞中添加外源性miR-来挽救成脂分化发现，用miR-模拟物转染的miR-KOFAP将其成脂分化显着降低至与WTFAP相似的水平（图2B）。体内、外实验数据证明miR-可以调节FAP的成脂分化。

Figure2

3、可以通过调节miR-来降低体内FAP成脂分化

骨骼肌损伤修复后，体内FAP激活期间miR-表达也增加（图3A）。通过FACS从他莫昔芬治疗的PDGFRaCreER、R26NG小鼠中分离了GFP阳性FAP细胞，并用miR-模拟物离体转染了这些细胞（图3B）。转染后，将这些细胞移植到肌肉损伤模型小鼠胫骨前肌，以诱导脂肪浸润。细胞移植后5天分离出体外移植细胞的胫骨前肌，并计算在脂肪区域Perilipin阳性脂肪细胞+GFP阳性细胞的数量来评估GFP+FAP对脂肪浸润的贡献（图3C）。在接受了miR-模拟物单次转染的FAP移植的肌肉中，观察到GFP阳性脂肪细胞数量减少了25％（图3D）。说明miR-可调节FAP成脂分化。

Figure3

4、miR-对FAP脂肪形成的分子调控机制

miR-KO小鼠的FAP具有成脂的倾向，与WTFAP相比，miR-KOFAP转录组将富含脂肪形成基因和miR-转录目标。因此对KO和WTFAP进行了RNA-seq，并鉴定了两个细胞群之间差异表达的基因（图4A）。KOFAP中表达最高度差异的基因之一是干扰素激活基因b（Ifib）（图4A），在脂肪形成中具有已知作用。IPA分析之后，miR-KOFAP中转录因子经典途径被富集，且该途径在成脂分化后增加。RNA-seq数据集不仅包括miRNA间接调控的途径，还包括miRNA直接靶标。miRNA-mRNA相互作用的计算生物信息学预测可能不是十分准确。为了解决这些缺点，本实验使用修饰标记的miRNA下拉测序（LAMP-seq）直接寻找miRNA靶标。对于LAMP-seq，在miR-的3`末端标记了生物素以减少干扰RNA诱导的沉默复合物（RISC）的影响，有利于转录本的靶向基因的筛选。miR-LAMP-seq数据富集基因显示如图4D，检测到个在miR-pulldown列表中富集2倍以上的基因（图4D），其中72个被TarBase预测为miR-的靶标。分析出排名前20位的转录因子（TFs）可能对调控成脂程序至关重要（图4E）。Runx1包含在这些转录因子中，且与Ifib，Pyhin1等发生相互作用调节成脂分化。所以本实验将FAP的成脂分化过程中将Runx1用作miR-的靶标基因。

Figure4

5、miR-靶向Runx1抑制翻译并降低FAP成脂作用

Runx1转录本的miRNA靶标分析（TargetScan）是未检测到miR-靶标序列的。所以本实验使用VectorNTI软件评估了碱基对与整个成熟miR-序列的互补性。在Runx1转录本的外显子中发现了一个靶序列，该序列与成熟miR-的序列互补性为60％（22nt中的13nt）（图4F）。该序列在转录本（第一个外显子）中的早期位置与翻译干扰与转录本降解相一致。接下来，将Runx1克隆到psi-Check荧光素酶质粒中，测试Runx1与miR-的相互作用，双荧光素酶实验显示miR-与Runx1的直接结合（图4G），且点突变该序列中54％的互补碱基对阻碍了miR-与Runx1的相互作用（图4F和4G），证实了miR-在此区域直接结合Runx1。

6、Runx1可以调节FAP向脂肪分化

将miR-模拟物转染到miR-KOFAP中，然后将其在成脂分化培养基中生长2天（图5A和5B）。miR-模拟物增加后Runx1转录本没有显着降低（图5A）。但是，Runx1蛋白水平显著降低（图5B）。这些结果表明，miR-结合Runx1的mRNA抑制其翻译。

miR-靶向Runx1来限制其翻译和诱导FAP脂肪分化。将mir-KO的FAP中转入Runx1转录物靶向小干扰RNA（siRNA），siRNA敲低Runx1转录本和蛋白质水平降低（图5C）。Runx1-siRNA敲低的FAP几乎完全丧失了成脂分化能力（图5D）。说明Runx1是FAP脂肪形成的调节剂，并证明了成脂分化中Runx1的作用。使用慢病毒载体在WTFAP中过表达Runx1，导致Runx1蛋白和mRNA水平升高（图5E和5F）。Runx1蛋白表达的增加促进了WTFAP成脂分化（图5G和5H）。同时，CHIP实验验证Runx1可以结合与脂肪分化相关基因启动子。

Figure5

7、miR-模拟物可抑制骨骼肌中的有害脂肪浸润

向WT小鼠的胫骨前肌注射甘油，并同时注射经修饰用于体内递送的miR-模拟物。然后在5天后分离这些肌肉，冰冻切片检测肌纤维再生和Perilipin+脂肪浸润（图6A-6D）。在比较对照模拟物和miR-模拟物治疗的肌肉时，肌纤维大小之间没有显着差异（图6B和6C）。但是，用miR-模拟物治疗的骨骼肌中Perilipin+脂肪浸润减少了50％（图6A和6D）。这些数据证明了miR-模仿物在限制有害脂肪浸润的同时将对肌发生的影响降至最低。

Figure6

通过本期文献学习，你还对miRNA研究没有信心吗？

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