疾病概述

抗肌萎缩蛋白病是由DMD基因的致病性变异所导致的一组主要累及骨骼肌和/或心肌的X连锁隐性遗传性肌病。DMD基因的致病性变异引起多种抗肌萎缩蛋白（dystrophin）同源异构体的异常，其中Dpm异构体的异常导致患者出现骨骼肌和/或心肌的受累，形成抗肌萎缩蛋白病的典型表型谱系，包括Duchenne型肌营养不良（Duchennemusculardystrophy，DMD）、Becker型肌营养不良（Beckermusculardystrophy，BMD）以及X连锁扩张型心肌病（X-linkeddilatedcardiomyopathy，XLDCM）。

DMD/BMD的发病率在各个国家、地区和人种间无明显差异，每~名出生男婴中便有1例发病，我国的发病率约为1/[1]。

DMD患者通常在5岁前起病，多数在2~4岁便开始出现肢体无力的表现，出现典型的Gowers’征以及膝腱反射消失或减弱，逐渐出现鸭步、腰椎前凸以及踮脚尖走路。大部分患者的病情通常在7岁后开始加速进展，表现为不能完成Gowers’征、不能跑、不能独立上楼梯以及跟腱挛缩明显加重。未经治疗的DMD患者在13岁前便会丧失独立行走能力，晚期多因心衰或呼吸衰竭而在30岁前死亡。BMD患者的发病年龄相对较晚，可于5~50岁之间出现骨骼肌和/或心肌受累的表现，疾病进展也相对缓慢，患者在16岁后仍可独立行走，部分患者的寿命可持续到50~70岁不等。

DMD基因包含79个外显子，全长超过了2.2Mb，但99%的序列为内含子序列。在其广泛的内含子序列中存在着较多的散在重复元件，导致DMD基因易于出现拷贝数变异（大片段缺失/重复；CNV）以及结构变异。CNV约占DMD基因突变谱系的70%~80%，微小变异约占20%~30%。

幼儿期运动发育轻度迟滞，儿童期运动能力开始下降，并出现步态异常、跟腱挛缩、腰椎前凸等变化，查体可见明显双腓肠肌假肥大现象。结合血肌酶谱肌酸激酶明显升高（20~倍）、肌电图呈肌源性损害，可临床疑诊DMD/BMD。

目前DMD基因变异的常规检测方法是联合MLPA以及针对外显子及邻近内含子区域的二代测序。但据文献报道，用此类常规基因检测方法，仍有约6.85%的中国男性DMD患者未找到致病性变异[2]。

为了更全面地找到致病变异，金准基因特别推出DMD全长测序+RNA-seq检测方案，用以提高抗肌萎缩蛋白病的诊断率。此方法可以用于鉴定UTR、启动子、非经典剪接区域和深在度内含子区域中的变异（非编码区变异）以及复杂结构变异等。

医院袁云教授团队谢志颖博士在此方法基础上，建立了一套完善地鉴定DMD基因致病性变异谱系的检测方法（SGTS），抗肌萎缩蛋白病基因组明确诊断的诊断率达到99.86%，研究成果发表在国际权威遗传学杂志上（JournalOfMedicalGenetics，PMID:）[3]：

1.入组标准：

联合运用MLPA和针对外显子及邻近内含子区域的二代测序未发现致病性变异时，同时肌肉病理检查提示存在dystrophin蛋白异常表达的患者。

2.检测结果：

共入组了例临床疑诊的抗肌萎缩蛋白病患者，经过基于DNA水平的常规基因检测之后，名患者具有致病性DMD变异，名患者被确认患有其他肌病，仍有15例患者的致病性变异未明。之后针对该15例患者运用DMD全长测序结合RNA-seq测序之后，10例患者明确了DMD基因在DNA层面的致病性变异（P1-P6，P8-P11），1例患者只明确了RNA层面的潜在致病位点（P7），位点信息见表1。在99.86%（/）的抗肌萎缩蛋白病患者中发现了致病基因变异，其中1例仅在mRNA和蛋白水平上发现了致病基因变异，提示SGTS对抗肌萎缩蛋白病的分子诊断率接近%。

表1DMD基因致病性的内含子变异及复杂结构变异

P1-P6，P8-P9号患者先进行RNA-seq，鉴定出DMD基因的异常转录本，再通过DMD全长测序找出潜在致病位点（图1，图2）

图1P1-P6号患者内含子变异引起的DMD异常剪接的示意图

图2P8-P9号患者内含子变异引起的DMD异常剪接的示意图

P10号患者DMD全长测序检测发现DMD基因13号外显子存在AluY序列的异常插入，后续配合RNA-seq方法进一步证实（图3，图4）。

图3P10号患者DMD全长测序13号外显子BAM示意图

图4P10号患者DMD基因复杂结构变异示意图

11号患者经DMD全长测序发现21号外显子附近存在倒位现象。后续配合RNA-seq方法进一步证实（图5，图6）。

图5P11号患者DMD全长测序的21号外显子复杂结构变异（倒位）异常BAM示意图

图6P11号患者复杂结构变异引起的DMD基因异常剪接示意图

上述变异的致病性判断遵循的原则为：异常转录本的序列与DNA水平的变异是吻合的（遵循公认的GT-AG或GC-AG规则以及符合剪接预测算法的结果），则认为该变异是致病的[3-5]。

针对临床疑诊DMD患者的基因检测策略建议：

1）MLPA+二代测序检测DMD基因大片段缺失/重复及微小变异。

2）若未发现致病变异，则需通过RNA-seq鉴定出DMD基因的异常转录本。同时进行DMD全长测序，鉴定可能致病的内含子变异及复杂结构变异。

3）若还未发现致病变异，可进行三代测序，进一步鉴定可能致病的其他复杂结构变异。

图7疑诊DMD患者的基因检测流程示意图

联系人

医院神经内科袁云教授团队，联系人：神经内科谢志颖博士。

[1].进行性肌营养不良诊疗指南(年版)

[2].GuoR,ZhuG,ZhuH,MaR,PengY,LiangD,WuL.DMDmutationspectrumanalysisinChinesepatientswithdystrophinopathy.JHumGenet;60:–42.

[3].ZXie，CSun，YLiu，MYu，YYuan.Practicalapproachtothegeneticdiagnosisofunsolveddystrophinopathies:astepwisestrategyinthegenomicera.JMedGenet-.

[4].TrabelsiM,BeugnetC,DeburgraveN,CommereV,OrhantL,LeturcqF,ChellyJ,BovolentaM,NeriM,FiniS,FabrisM,TrabanelliC,VenturoliA,MartoniE,BassiE,SpitaliP,BrioschiS,GualandiF,FerliniA.Whenamid-intronicvariationofDMDgenecreatesanESEsite.NeuromusculDisord;24:–7.

[5].GonorazkyH,LiangM,CummingsB,LekM,MicallefJ,HawkinsC,BasranR,CohnR,WilsonMD,MacArthurD,MarshallCR,RayPN,DowlingJJ.Rnaseqanalysisforthediagnosisofmusculardystrophy.AnnClinTranslNeurol;3:55–60.

金准基因结合临床和科研需求、考虑特殊疾病及基因、运用多种技术手段，开发出多种产品检测方案，包括：基因覆盖范围由大到小的WGS、WES及panel检测方案；线粒体基因组及CNV检测方案；基因机制复杂可能涉及多技术的特色检测方案等。数据分析和挖掘，不仅仅应用公共数据库，更重要的是我们构建了内部疾病数据库，结合AI算法、表型及遗传模式双驱动数据分析方式，更准确评估变异位点的致病性，提高基因检测阳性率，助力新基因的发现。

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